СРАВНИТЕЛьНЫЙ АНАЛИЗ ВИДОВОЙ ИДЕНТИФИКАЦИИ ГРИБОВ РОДА ASPERGILLUS, CRYPTOCOCCUS, CANDIDA И TRICHOPHYTON ТРАДИЦИОННЫМИ КУЛьТУРАЛьНЫМИ И МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИМИ МЕТОДАМИ (IDENTIFICATION OF ASPERGILLUS SPP., CRYPTOCOCCUS SPP., CANDIDA SPP., TRICHOPHYTON )

Пестова Н.Е., Богданов К.В., Пицик Е.В., Горбунова А.В., Игнатьева С.М.
Pestova N.E., Bogdanov K.V., Pitsik E.V., Gorbunova A.V., Igtatуeva S.M.

Abstract: 

IDENTIFICATION OF ASPERGILLUS SPP., CRYPTOCOCCUS SPP., CANDIDA SPP., TRICHOPHYTON SPP. BY USING THE TRADITIONAL CULTURAL AND MOLECULAR GENETIC METHODS

Введение. Секвенирование ДНК по генам рРНК стало универсальным молекулярным методом идентификации микроорганизмов, в том числе микроми-цетов. Гены, кодирующие рРНК эукариот, включают консервативные и неконсервативные участки, которые могут быть использованы для проведения филогенетического анализа. Оперон рибосомальной РНК состоит из четырех генов: 18S (малая субъединица), 5.8S, 28S (большая субъединица) и 5S. Известно, что локусы внутреннего транскрибируемого спейсера ITS и D1/D2 (NL) 28S субъединицы являются наиболее вариабельными, и поэтому их часто используют для видовой идентификации грибов.

Цель исследования - проведение видовой идентификации грибов из Российской коллекции патогенных грибов НИИ Медицинской микологии им. П.Н. Кашкина и клинических изолятов от пациентов, находящихся в микологической клинике, методом сиквенирования.

Материалы и методы. Исследовали образцы ДНК, полученные из чистых культур аспергиллов, криптококков, кандид и трихофитонов (n=51). Для всех микромицетов была проведена видовая идентификация с использованием традиционных культуральных и молекулярно-генетических методов анализа, включающих сиквенирование локуса ITS и региона D1/D2 - NL с помощью генетического анализатора 3500 (Applied Biosystems). Оценку результатов сиквенирования проводили с помощью программного обеспечения (DNA Sequencing Anafysis Software v.5.4; Applied Biosystems).

Результаты. Для каждого рода гриба оптимизировали условия амплификации с использованием праймеров ITS1, ITS4 и NL1, NL4 соответственно.

Было проанализировано 27 образцов ДНК, выделенных из Candida spp. Сиквенирование по локусу ITS оказалось достаточным для видовой идентификации Candida spp., за исключением вида C. krusei, для которого результаты, полученные традиционными и молекулярными методами, не совпадали. Поэтому для более точной идентификации Candida spp. следует проводить анализ по локусу NL и/или р-тубулину.

Сиквенирование ITS-локуса 14 образцов ДНК, выделенных из Cryptococcus spp., оказалось достаточным для их видовой идентификации и подтверждало результаты культуральных исследований.

Молекулярно-генетическим анализом 8 культур Aspergillus spp. по двум локусам (ITS1 и NL1) показано, что идентификация видов этого рода грибов более информативна при сиквенировании по ITS, чем по NL.

Анализ 2 образцов ДНК, выделенных из Trichophyton spp., проводили по двум локусам - ITS1/ITS4 и NL1/NL4. Результаты сиквенирования совпадали с культуральными исследованиями только для T. men-tagrophytes var. interdigitale. Идентификация T. viola-ceum молекулярными методами была мало информативна и необходимо проведение сиквенирования по другим генам, например р-тубулину.

Выводы. Сиквенирование по рибосомальным генам, в частности участку внутреннего транскрибируемого спейсера ITS, можно эффективно применять для видовой идентификации Aspergillus spp., Cryptococcus spp., Candida spp. и Trichophyton spp. В случае, если сиквенирование по этому локусу мало информативно, то следует рекомендовать проведение генетического анализа ДНК по локусу NL или р-тубулину.
 

2010

Full conference title: 

RUSSIAN-CHINESE SCIENTIFIC-PRACTICAL CONFERENCE ON MEDICAL MICROBIOLOGY AND CLINICAL MYCOLOGY (XIIV KASHKIN READING)