Az Aspergillus nidulans var. roseus ATCC 58397 törzs jellemzése, echinocandin B és szterigmatocisztin termelésének vizsgálata

Full title: 

Az Aspergillus nidulans var. roseus ATCC 58397 törzs jellemzése, echinocandin B és szterigmatocisztin termelésének vizsgálata
Az Aspergillus nidulans var. roseus ATCC 58397 törzs jellemzése, echinocandin B és szterigmatocisztin termelésének vizsgálata Characterization of Aspergillus nidulans var. roseus ATCC 58397, investigation its echinocandin B and sterigmatocystin production

Author: 

Tóth, Viktória

Year: 

2012

Reference type: 

Book

Abstract: 

Az elmúlt évtizedekben a különböző típusú, főleg invazív mikózisok száma, jelentősen megemelkedett. Az Aspergillus nidulans var. roseus ATCC 58397 echinocandin B (ECB) termelése révén egy ipari jelentőségű fonalas Ascomycota gomba. Vizsgálataink alapján az A. nidulans var. roseus ATCC 58397 törzs sima falú aszkospórái ellenére sem tartozik az A. nidulans fajba, sokkal inkább az A. rugulosus törzsekkel mutat közeli rokonságot. Erre utalt a kalmodulin, β-tubulin és γ-aktin gének parciális szekvenciája, növekedésének/szénforrás hasznosításának hőmérséklet függése és szekunder metabolit termelése is. Az A. nidulans és az A. rugulosus, illetve az A. nidulans és az A. nidulans var. roseus közötti sikeres paraszexuális hibridizáció ugyanakkor felveti annak lehetőségét, hogy egyes szokatlan tulajdonságú Aspergillus törzsek (köztük akár az A. nidulans var. roseus is) fajok közötti kereszteződés segítségével tettek szert rendhagyó tulajdonságaikra. Az A. nidulans var. roseus echinocandin rezisztenciájának vizsgálata alapján elmondhatjuk, hogy a törzs nem rendelkezik konstitutív echinocandin rezisztenciával a saját maga által termelt ECB-vel szemben. A rezisztencia kialakulásában fontos szerepet játszhatott a kitin szintézis aktiválódása, a specifikus β-1,3-glükán szintáz aktivitások emelkedése és a vegetatív növekedés jelentős lassulása is. Az A. nidulans var. roseus ECB termelését alapvetően meghatározza a tenyésztési hőmérséklet. Vizsgálataink alapján a tenyésztési hőmérséklet csökkentése jelentős transzkripciós szinten is detektálható változást idézett elő a törzsben. A megfigyelt transzkripciós és fiziológiai vizsgálatok alapján, ECB termelő körülmények között nőtt a nitrát redukció intenzitása, nőtt a tenyészetek specifikus kataláz aktivitása, valamint a lipid anyagcsere (zsírsav, triglicerid, szteroid szintézis/lebontás) egyensúlya a szintézis irányába tolódott el. A kísérleteinkhez használt GNL tápleves összetevői közül a szójapepton jelenléte alapvetően meghatározta a termelt szterigmatocisztin (ST) mennyiségét. Optimalizációs vizsgálatainkban a szójapepton Tyr-nal történő helyettesítésével sikerült egy olyan tápközeget kialakítani, amelyben számottevően csökkent a termelt ST mennyisége anélkül, hogy ez a képződött ECB koncentrációját lényegesen csökkentette volna. Kísérleteinkben a napraforgóolaj jelenléte nélkülözhetetlennek bizonyult a hatékony ECB termeléshez. A napraforgóolaj jelenléte - azon túl, hogy a belőle felszabaduló linolsav közvetlenül beépülhet az ECB-be - több ok miatt is előnyös lehetett: 1) Biztosította a tenyészet lassú növekedését. 2) Mérsékelte a tenyészetek megnövekedett lipid szintézis igényét. 3) Gátolta a tenyészet lúgosodását. Vizsgálatainkban négy különböző, fonalas gombák által termelt, a sejtfal homeosztázist befolyásoló antifungális molekula hatása közötti interakciót teszteltük. A kapott eredmények összefoglalásaként elmondható, hogy az ECB antagonista módon viselkedett a PAF-fal, azaz a P. chrysogenum által termelt antifungális fehérjével szemben a fonalas gombák esetében. A sejtfalbontó hidrolázok ugyanakkor szinergista kölcsönhatást mutattak az ECB-vel mind az élesztők, mind a fonalas gombák esetében. E hatás megerősíti azt az általános tapasztalatot, miszerint többféle, eltérő működésű sejtfalkárosító anyag kombinált alkalmazása megnöveli antifungális aktivitásuk hatékonyságát és alátámasztja azon feltételezésünket, miszerint a konstitutív ECB rezisztencia nem előnyös az A. nidulans var. roseus számára, mert megnövelheti más sejtfal stresszorokkal szembeni érzékenységét. Fungal infections, especially invasive mycoses, have become an important health problem in the last decades. Aspergillus nidulans var. roseus ATCC 58397 is an industrially important filamentous Ascomycota strain owing to its production of the antifungal compound echinocandin B (ECB). We found that the A. nidulans var. roseus isolate does not belong to A. nidulans species, despite of its smooth-walled ascospores, rather it shows close similarity to A. rugulosus strains. It was supported by the partial DNA sequence data of calmodulin, β-tubulin and γ-actin genes, the temperature dependence of its growth on different carbon sources and its secondary metabolite production. The possibility of parasexual hybridization between A. nidulans and A. rugulosus as well as between A. nidulans and A. nidulans var. roseus raises the question if some of the taxonomically not fixed Aspergillus isolates, including A. nidulans var. roseus, are the consequence of gene exchanges during the parasexual hybridization of different closely related Aspergillus species. The ECB resistance of A. nidulans var. roseus can be explained with the induction of chitin biosynthesis, the increased β-1,3-glucan synthase activity as well as the reduced vegetative growth. ECB production of A. nidulans var. roseus is depends highly on the culturing temperature. According to our experiments, the reduction of cultural temperature from 37 ºC to 24 ºC had significant effects on the physiology of the culture that could be detected on even transcription level. Under ECB producing conditions intensification of nitrate reduction, increase in catalase activities as well as a shift towards synthesis in the balance of lipid metabolism was observed. According to our results soybean peptone, a component of GNL broth used for ECB production, proved to be important in supporting sterigmatocystin (ST) formation. By replacement of soybean peptone with Tyr and by optimization the composition of this medium we could markedly decrease the ST content of the fermentation broth without significantly decreasing the amount of produced ECB. Sunflower oil proved to be necessary for efficient ECB production. presence of sunflower oil in the fermentation broth can be advantageous in many ways: 1) It ensured continuous growth of the culture. 2) It reduced the need of intensive lipid synthesis supposed. 3) It prevented the alkalification of culture by releasing fatty during its extracellular hydrolysis and by inhibiting ammonia production of the cells. 4) In addition it reduced the antifungal effect of the produced ECB on the fungus. We tested the pairwise interactions between four different antifungal molecules potentially affecting cell wall homeostasis. Summing up the results, ECB and PAF (antifungal protein produced by Penicillium chrysogenum) showed antagonistic effect on the tested filamentous fungi. Cell wall degrading hydrolases showed synergist interaction with ECB in the cases of both yeasts and filamentous fungi. This effect is in good accordance with previous findings showing that combined usage of different types of cell wall degrading compounds increases the efficiency of their antifungal activity. These data also support our assumption that constitutive ECB resistance and production is not advantageous for A. nidulans var. roseus, since it can increase its sensitivity to other cell wall stressors